荧光斑马鱼，养斑马鱼三忌

长尾蝶翼荧光斑马鱼，还没有入坑的，千万要注意。

这个鱼从上往下观察，看上去很漂亮。

一旦放到鱼缸里，从侧面看，真是走丑到了极限:弯头斜背，行动迟缓。

使用基于荧光 PCR 的筛选有效敲入斑马鱼点突变和表位标签的稳健管道

背景

使用 CRISPR/Cas9 进行基因组编辑已成为斑马鱼生成靶向基因敲除模型的强大工具。然而，由于斑马鱼中低效的同源定向修复 (HDR) 通路，其用于靶向敲入仍然具有挑战性，这凸显了对高效且具有成本效益的筛选方法的需求。

结果

在这里，我们展示了我们基于荧光 PCR 和毛细管电泳的筛选方法，使用单链寡脱氧核苷酸供体 (ssODN) 作为修复模板，用于靶向插入表位标签或单核苷酸变化以概括致病性人类等位基因。对于表位标签的插入，我们利用了 PCR 产物大小的预期变化。对于点突变，我们将荧光 PCR 与限制性片段长度多态性 (RFLP) 分析相结合，以区分具有敲入等位基因的鱼。

作为原理验证，我们展示了我们关于鱼线生成的数据，其中在 tcnba 基因座插入了 FLAG 标签，在gata2b基因座插入了 HA 标签，并且在戈谢病患者中观察到了点突变gba基因。尽管种系传播创始人的数量很少（1-5%），但将我们的筛选方法与通过鳍活检确定创始人鱼的优先次序相结合，使我们能够通过筛选每个基因 12 条或更少的鱼来建立稳定的敲入线。

结论

我们已经建立了一个强大的管道来生成斑马鱼模型，在基因组中的所需位点精确整合小 DNA 序列和点突变。我们的筛选方法非常有效且易于实施，因为它基于 PCR，并且只需要使用毛细管测序仪。

斑马鱼是一种流行的功能基因组学和人类疾病模型研究的脊椎动物模型系统，因为它们具有外部受精、光学透明胚胎、高繁殖力、快速胚胎发育、进化上保守的生物途径以及遗传操作方法的可用性， 靶向基因组编辑技术的最新进展，尤其是成簇规则间隔短回文重复序列 (CRISPR)/Cas9，使得在斑马鱼中生成理想的基因敲除模型变得相对容易， 这些方法利用容易出错的非同源末端连接 (NHEJ) 通路，该通路由 CRISPR/Cas9 引起的双链断裂 (DSB) 激活 。

我们的实验室和其他实验室已经开发出高通量和具有成本效益的方案，使用 CRISPR/Cas9 在斑马鱼中产生单个或多个基因敲除。同样，CRISPR/Cas9 介导的靶向诱变已被用于通过提供 DNA 修复模板激活同源定向修复 (HDR) 通路来生成具有所需外源序列靶向敲入的鱼类模型，已被证明在斑马鱼中起作用，它们的选择取决于要插入的货物的大小。使用靶向敲入生成的鱼线示例包括添加用于基因表达实时分析的荧光报告基因、用于蛋白质水平分析的表位标签、用于条件性分析的 loxP 位点基因敲除 和核苷酸替换以分析疾病特异性点突变。

HDR 的靶向敲入在斑马鱼中仍然是一个具有挑战性的过程，因为与 NHEJ 相比，HDR 的效率非常低，因此，需要进行广泛的筛选来识别将精确整合的修复模板传递给其后代的稀有创始人鱼。此外，由于NHEJ引起的同时插入缺失或由于重组过程中的错误，敲入事件通常不精确。由于缺乏可视化工具，如荧光报告器，使用 ssODN 时，精确敲入的筛选尤其困难，可用于具有较大修复模板的敲入。

因此，昂贵且劳动密集型的方法，例如大量克隆的克隆和测序或汇集胚胎的下一代测序 (NGS)，用于确定使用 ssODN 进行敲入的成功与否， NGS 需要使用特殊设备和生物信息学专业知识来处理大量测序数据，因此对许多实验室提出了挑战。虽然 TIDER（插入、删除和重组事件跟踪）和 ICE（CRISPR 编辑推断）等在线工具可用于确定敲入效率并从 Sanger 测序数据推断编辑序列，但这些方法需要很高的质量序列读取。

如果一个特定的核苷酸在色谱图中没有很好地表现出来，它可能会导致推断序列中的错误，特别是对于点突变的敲入。最近，Prykhozhij 及其同事 表明，等位基因特异性 PCR (AS-PCR) 与限制性消化的组合准确地识别了来自点突变的脱靶反式敲入事件的真正敲入。然而，AS-PCR 是一种基于凝胶的方法，因此难以扩大规模。

因此，我们研究的目标是使用其他人可以轻松实施的 ssODN 开发稳健的敲入筛选方法。此前，我们开发了基于毛细管电泳的荧光 PCR 产物片段分离技术，用于对具有插入缺失及其修饰的基因敲除鱼系进行准确基因分型，称为 CRISPR-STAT（CRISPR 体细胞组织活性测试），用于评估 sgRNA活性， 在这里，我们描述了我们如何将荧光 PCR 和 CRISPR-STAT 用于体细胞和种系筛选以检测 ssODN 的精确整合。

温州大学：硫化氢是大气中的一种急性神经毒性气体，是威胁人类健康的重要大气污染物。到目前为止，对开发有效解毒剂的研究还很有限，目前还没有合适的解毒剂用于治疗硫化氢中毒。因此，硫化氢毒性的致病机制仍需进一步研究。

斑马鱼胚胎-幼鱼作为研究硫化氢致病机制的优点：（I）斑马鱼与人类基因组的相似度高达87% ，有与人类近似的毒性特征和信号传导通路，斑马鱼的各种器官和组织在解剖学、生理学和分子水平上已经被证实类似于哺乳动物，斑马鱼已被广泛应用于遗传和发育、环境、病理等毒理学研究领域；（II）斑马鱼体型小，不仅饲养成本低，而且药物用量少。此外，斑马鱼实验周期短，大部分实验能够在1 ~ 7 d 内完成。斑马鱼易于大量繁殖，单次产卵量高，可提供大量单组实验样本，实验统计分析结果可信度高。（III）斑马鱼幼鱼实验通量高，胚胎透明，易于观察和操作，可结合活体染料、荧光示踪、抗体、核酸探针等方法同时观察化合物对多个器官的毒性反应，可以快捷、高效、直观地评价药物的发育毒性，对发育毒性的预测准确性可以达到80%以上；（IV）在环境中的毒性，还需模拟真实环境，开展低浓度和长时间暴露的慢性毒性实验，以斑马鱼胚胎作为实验对象有利于节约空间、时间及成本，更重要的是化学品在流水暴露条件下更贴近于真实水体环境。因此，斑马鱼作为慢性毒性实验模型具有显著优势。

实验方法：本研究将斑马鱼胚胎连续暴露于含有硫化氢的培养液中建立实验模型，对斑马鱼幼体进行了H2S诱导的发育毒性、活性氧积累、抗氧化系统功能、细胞凋亡和线粒体功能的检测。此外，对斑马鱼幼体进行了转录组测序分析并进一步RT-qPCR验证。

实验结果：H2S导致斑马鱼幼体存活率降低，同时引起脊椎畸形和器官水肿。H2S暴露破坏了斑马鱼胚胎-幼鱼的抗氧化系统，引起了线粒体功能障碍。此外，斑马鱼幼体的细胞凋亡率、caspase-3活性和Bcl-2家族蛋白中的促凋亡相关基因的转录均增加，增加了斑马鱼幼体的细胞凋亡。

实验结论：斑马鱼作为一种与人类基因组高度同源的模式动物，为了探讨H2S的致病机理展开了以下研究，对斑马鱼幼体的畸形和存活率分析、转录分析、细胞内ROS、Ca2+和NO的含量、抗氧化系统的测定和细胞凋亡的检测。结果表明，长时间的H2S暴露会产生过量的ROS积累，进一步损害线粒体的结构和功能，导致钙离子和细胞色素c氧化酶从线粒体释放到细胞质，异常的细胞凋亡被高强度地激活，导致斑马鱼幼体严重的发育毒性或死亡。这项研究可能为开发治疗慢性硫化氢暴露的药物提供了有价值的信息。

参考文献：

Yinai Liu; Qianqian Chen; Yaoqi Li; Liuliu Bi; Sue Lin; Hao Ji; Da Sun; Libo Jin; Renyi Peng. Hydrogen sulfide-induced oxidative stress mediated apoptosis via mitochondria pathway in embryo-larval stages of zebrafish.

原文链接：网页链接

奇妙的斑马鱼！

作为一种模式生物，斑马鱼可以建立各种转基因品系。

克隆相关基因的含有其调控元件的启动子序列，与报告基因如绿色萤光蛋白GFP连接，构建表达载体，再微注射到单细胞胚胎内，就可以在显微镜下，看到被绿色萤光蛋白“点亮”的区域。

妙哉！奇哉！

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#斑马鱼#

“探秘”重点实验室 成都科技周特色科普活动等你“打卡”

本周五，2021年成都市科技活动周将正式启幕，科普剧、夜观活动、实验室“探秘”等百余项特色科普活动将陆续“上新”。

绿道科普嘉年华活动丰富

绿道是本次成都市科技活动周的关键词。在此次绿道科普嘉年华活动上，四川新生命干细胞科技股份有限公司干细胞科普教育中心将在清水河生态艺术公园开展一场以“废物再利用 绿色伴我行”为主题的科普活动，让市民了解脐带血、脐带、胎盘、脂肪、脱落乳牙等废弃的医疗组织中所蕴含的干细胞价值。

成都许燎源现代设计艺术博物馆将在花乡农居绿道开启绿道艺术装置美育互动科普。现场将用艺术手法创作出一组超现实主义的装置作品——“熊猫嬉戏竹林”，引发公众对人与自然环境的思考。

成都大熊猫繁育研究基地也将公开招募，让孩子们认识不一样的大熊猫和身边的鸟兽虫木，发现物种间彼此依存的关系，了解人类保护大熊猫的真正意义。

中国科学院成都生物研究所两栖爬行动物科普馆也将在成都锦城湖开启“生物之魅”绿道夜观活动，在夜间带领约20组家庭在锦城湖周围寻找和观察成都本土蛙类及其他小动物，让参与者理解保护生态环境的重要性。

众多博物馆联手开启“奇妙夜”

本次科技活动周，众多博物馆将联手为市民开启一场“博物馆奇妙夜”——

成都生命奥秘博物馆将开展“博物馆奇妙夜——我是标本护理师”活动，征集12名对生物科学、医学感兴趣的小朋友，化身标本护理师，体验夜间标本护理的工作。

拾野自然博物馆也将开设主题专场活动，通过博物馆夜间探秘和夜宿博物馆环节，让参与活动的孩子们体验不一样的博物馆之旅。

一大批重点实验室也将在科技周向公众开放。四川大学华西医院精准医学四川省重点实验室将围绕精准医学、基因、基因检测、肿瘤、微生物等大众所关心的生物医学领域热门词汇进行科普，同时介绍实验室新冠病毒抗疫成果。四川大学疾病分子网络前沿科学中心也将开展生命健康专题讲座，市民可参与制作个人手掌细菌或病毒足迹、头发DNA提取及为斑马鱼显微注射荧光病毒等实验互动。

UVA照射后光感受器细胞是否会坏死？为何会坏死？

通过受体相互作用蛋白激酶，介导的坏死诱导视网膜光感受器细胞死亡，由于臭氧消耗和地球表面的全球气候变化，人类暴露于紫外线辐射的情况正在增加。

紫外线辐射，比可见光或红外光含有更多的能量，因此有更大的生物损伤。

事实上，由于它直接照射人眼，它被认为与许多眼病有关。在一项对人RPE细胞的研究中，观察到UVC诱导的时间依赖性细胞死亡。

另一项研究表明，UVB导致RPE细胞中DNA链断裂的形成，这是年龄相关性黄斑变性发展的危险因素。

然而，UVA诱导视网膜细胞损伤的机制，和潜在的新的保护或治疗方法的识别，作为一个研究领域一直相对被忽视。

UVA辐射是唯一到达视网膜的紫外光，通过非DNA发色团吸收光子对DNA造成间接损伤。

这将产生活性氧，如单线态氧或过氧化氢，氧化DNA碱基，导致细胞DNA损伤，从而导致程序性细胞死亡。

PCD负责各种前、后眼部疾病的发病机制，主要包括Fuchs内皮性角膜营养不良、青光眼、新生血管性AMD和色素性视网膜炎。

许多因素影响PCD过程，包括改变蛋白水平和其他大分子物质功能障碍、线粒体功能障碍和氧化应激。

最近的研究表明，多种细胞基因表达介导PCD，主要包括细胞凋亡、自噬、坏死、铁塌和焦亡等。坏死，作为PCD的另一种形式，也被称为程序性坏死。

坏死表现出类似于，坏死和凋亡的形态学特征，并受到多蛋白相互作用的严格调控。

坏死可以补偿抑制后的细胞凋亡，坏死依赖于一种被称为坏死小体的信号复合物，它包含受体相互作用的蛋白激酶RIPK1、RIPK3和混合谱系激酶结构域样。

RIPK1和RIPK3之间的相互作用，导致RIPK3-RIPK3同源相互作用和RIPK3自磷酸化，形成了坏死体的关键元素。

混合谱系激酶结构域样仅被RIPK3招募和磷酸化，然后易位到细胞膜上执行坏死。虽然RIPK3和RIPK1都需要诱导坏死，但当在细胞中过表达时，RIPK3单独可以促进坏死。

RIPK3不仅是坏死途径中的重要信号因子，而且对干细胞的发育、多能干细胞的诱导、一般稳态、组织损伤应答和抗病毒免疫也有重要作用。

先前的研究表明，RIP3在实验性视网膜，脱离小鼠模型中介导光感受器损伤/死亡。此外，RIPK3的敲除或消耗减少了，斑马鱼和小鼠的光感受器细胞死亡。

然而，关于uva通过RIPK相关途径诱导的光感受器损伤，我们知之甚少。

在这里，我们旨在研究坏死的影响，以及RIPK1和RIPK3在uva诱导的光感受器损伤的体外，和体外模型中的作用，为了研究UVA在光感受器细胞中的作用，我们建立了一个包含4种不同辐射强度（0、3.5、7和10.5 J/cm2）的，光感受器细胞系的体外UVA损伤模型。

在UVA暴露24小时后，我们观察到大量的ROS产生。与此同时，乳酸脱氢酶（LDH）的释放水平比对照组高2.7-4.0倍，表明随着UVA剂量的增加，细胞死亡持续增加。同样，MTT结果显示细胞活性下降。

为了进一步阐明uva诱导的光感受器，损伤的机制，我们通过膜联蛋白和碘化丙啶染色，检测了细胞死亡的阶段。

Annexin V阳性和PI阴性染色，传统上用于识别早期凋亡细胞死亡，但早期坏死阶段也显示出相同的染色模式。因此，我们使用Annexin V/ PI，在uva诱导的光感受器损伤模型中，区分早期和晚期PCD。

有趣的是，光感受器主要表现为晚期PCD形态[膜联蛋白V（+）、PI（+）]，而不是早期PCD[膜联蛋白V（+）、PI（−）]、坏死[膜联蛋白V（−）、PI（+）]或活菌形态。这个可能代表晚期细胞凋亡或晚期细胞坏死。

此外，Western印迹法和免疫荧光法，显著上调了RIPK3的表达，而UVA也诱导了RIPK3的剂量，依赖性磷酸化。

与RIPK3相比，我们无法检测到RIPK1，或磷酸化的RIPK1（ρ-RIPK1）的任何变化，这是RIPK3的上游激活物然而，RIPK3和PCD标记物的关键下游合作伙伴，MLKL和Poly（ADPribose）聚合酶-1（PARP）显著上调。

TUNEL/RIPK3双标记染色进一步支持了，UVA照射后光感受器细胞坏死死亡的证据。Caspase 8和Caspase 3的裂解，也以剂量依赖性的方式被观察到，表明细胞凋亡也参与了其中。